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EGE技术基因敲除/敲入鼠

2016-02-26 14:08:46.0

1. CRISPR-Based EGE技术简介

CRISPR(clustered,regularly interspaced,short palindromic repeats)是一种来自细菌降解入侵的病毒DNA或其他外源DNA的免疫机制。在细菌及古细菌中,CRISPR系统共分成3类,其中Ⅰ类和Ⅲ类需要多种CRISPR相关蛋白(Cas蛋白)共同发挥作用,而Ⅱ类系统只需要一种Cas蛋白即可,这为其能够广泛应用提供了便利条件。目前,来自Streptococcus pyogenes的CRISPR/Cas9系统应用最为广泛。

Cas9蛋白(含有两个核酸酶结构域,可以分别切割DNA两条单链。Cas9首先与crRNA及tracrRNA结合成复合物,然后通过PAM序列结合并侵入DNA,形成RNA-DNA复合结构,进而对目的DNA双链进行切割,使DNA双链断裂。

由于PAM序列结构简单(5’-NGG-3’),几乎可以在所有的基因中都能找到大量靶点,因此得到广泛的应用。CRISPR/Cas9技术已经成功应用于植物、细菌、酵母、鱼类及哺乳动物细胞,是目前最高效的基因组编辑技术。

通过基因工程手段对crRNA和tracrRNA进行改造,将其连接在一起得到sgRNA(single guide RNA)。融合后的RNA具有与野生型RNA类似的活力,但因为结构得到了简化,更方便研究者使用。通过将表达sgRNA的元件与表达Cas9的元件组装到一个载体中,得到可以同时表达两者的质粒,将其转染细胞,就能够对目的基因进行操作。

目前的CRISPR/Cas9技术应用于基因敲入时,外源DNA同源重组效率一直很低。为提高其重组效率,百奥赛图在CRISPR/Cas9技术基础上开发和优化出一套高效的基因敲除/敲入技术(Biocytogen Extreme Genome Editing System,简称EGE技术)。该技术比普通的CRISPR/Cas9技术介导的同源重组效率提高了10-20倍,从而使得基因改造更加快速和方便。利用EGE技术几乎可以在基因组中的任意位点,对DNA序列进行各种精确地编辑,从而实现条件性基因敲除、全基因敲除、基因敲入及点突变的目的。2015年9月,百奥赛图成功注册“EGE”商标 。

 

2. CRISPR-Based EGE系统制备模式动物流程图

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3.服务流程

百奥赛图提供一站式定制化小鼠模型构建服务,包括模型设计、构建及基因型鉴定服务

3.1 项目的可行性评估及模型设计

百奥赛图拥有一支专家级技术团队,专门负责对项目的可行性进行全面分析,并提供完全免费的专业模型设计服务,服务的内容包括:

Ÿ   明确模型构建的目的

Ÿ   分析目的基因的结构与序列组成信息

Ÿ   分析已有文献数据

Ÿ   设计出所有可能的模型构建方案

Ÿ   分析所有模型构建方案的优势与风险

Ÿ   精确的项目实施时间表及项目报价

3.2打靶载体的设计与构建

Ÿ   课题设计,合成引物

Ÿ   CRISPR/Cas9质粒构建

Ÿ   sgRNA 活性检测

Ÿ   打靶载体构建

Ÿ   CRISPR/Cas9体外转录制备mRNA

3.3原核注射

Ÿ   小鼠受精卵注射 CRISPR/Cas9 mRNA

3.4获得F0代鼠并繁殖

Ÿ   移植受体母鼠的饲养与F0出生

Ÿ   嵌合鼠与野生小鼠的合笼交配

3.5获得种系遗传的F1代杂合小鼠

Ÿ   F1代小鼠的出生

Ÿ   F1代小鼠的鼠尾基因型鉴定确认种系遗传

 

3. CRISPR-Based EGE技术优势

高速度:最快2个月即可得到F0代阳性鼠,5个月得到F1

零风险:强大的生产平台支持,课题失败全额退款

高效率:比现有的CRISPR/Cas9介导的基因重组效率提高20倍

高质量:坚持Southern blot,最大限度降低由于随机插入造成的后续实验风险

多样化:全基因敲除、条件性基因敲除、基因敲入等

无物种限制:细胞系,小鼠,大鼠,猪,猴,斑马鱼等

 

4.应用

 4.1.基因敲入大鼠

2014年2月,百奥赛图利用EGE技术成功开发出了CD4-dsRed和FoxP3-DTR-EGFP报告基因敲入大鼠。到目前,公司承接国内外委托定制的基因敲除大鼠、条件性敲除大鼠及基因敲入大鼠模型70余种,标志着公司在基因敲除/敲入大鼠模型开发的新技术研发方面,已处于国内领先和国际前沿的地位。利用EGE技术,百奥赛图已经为客户制备了基因敲入大/小鼠200余种。

 

4.2.基因敲入细胞系

利用EGE技术,百奥赛图制备了在ACTB(细胞骨架丝状蛋白)基因编码框翻译起始位点敲进EGFP(融合蛋白)的U2OS细胞系,以及在LMNB1(核膜蛋白)基因编码框起始位点敲进EGFP(融合蛋白)的大鼠C6细胞系。

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利用流式细胞术分析重组效率发现,在U2OS细胞系中,CRISPR/Cas9介导的EGFP-ACTB基因敲进效率只有1.91%,而EGE可以达到15.02%,提高了约8倍。在C6细胞系中,EGE技术将EGFP-LMNB1的敲进效率从0.19%提升至3.6%,提高了约19倍。


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